油棕栽培技术粗放，不与粮争地，利用热区盐碱地种植油棕，拓宽油料生产对于缓解我国“粮油争地”矛盾、增强食用油安全供给能力意义重大。目前，有关油棕耐盐基因及耐盐胁迫分子机制的鲜有报道，鉴定挖掘油棕耐盐基因及基因功能分析，对深入解析油棕耐盐分子机制奠定基础。
近日，热带作物生物育种全国重点实验室/中国热带农业科学院椰子研究所/油棕研究团队周丽霞副研究员在植物科学领域国际知名期刊International Journal of Molecular Sciences（中科院大类分区生物学二区，IF=5.6）在线发表了题为“The oil palm AP2 subfamily gene EgAP2.25 improve salt stress tolerance in transgenic tobacco plants”的文章。该研究针对油棕耐盐基因不明确，盐胁迫应答分子机理解析不清这一科学问题，在前期工作基础上，对EgAP2.25基因的特性进行分析，并借助异源过表达、耐盐生理指标测定及marker基因表达分析，明确了该基因可显著提高转基因株系的耐盐性。研究为耐盐油棕品种选育奠定良好的理论基础。
前期，该研究团队已完成了油棕172个AP2/ERF基因的发掘与鉴定。本研究进一步分析了油棕EgAP2.25的序列特征和表达模式，发现EgAP2.25蛋白中有10个保守基序和两个AP2/ERF保守结构域，分别位于197–266个氨基酸和301–360个氨基酸（图1a和1c）；EgAP2.25基因包含7个外显子和6个内含子（图1b）。通过预测EgAP2.25基因上游2000 bp启动子序列，获得了与胁迫（P-box、TATC-box、CGTCA基序、GC基序和TGACG基序）和植物生长（G-box、G-box、AT1基序、ATCT基序、GATA基序和TCCC基序）相关的顺式作用元件（图1d）。通过预测和分析EgAP2.25蛋白的三级结构，发现该蛋白在TM2和TM3之间具有7个与激素相关的跨膜结构域（TMs）（图1e）。此外，EgAP2.25在盐胁迫24小时显著过表达（图1f）。
图1油棕EgAP2.25基因的特征分析
通过观察野生型（WT）和EgAP2.25转基因烟草种子分别在不同浓度NaCl下生长状况，发现所有野生型和转基因植株在正常浇水条件下生长良好。值得注意的是，在300mM NaCl下，野生型品系的发芽率（19%）明显低于转基因植物的萌发率（70%）（图2a和2b）。此外，随着盐浓度的增加，野生型和转基因株系的根长均显著下降。然而，在200mM NaCl下，T1、T2和T3转基因植株的根长明显长于WT株系（p<0.05）。当盐浓度达到300mM时，根长度显著减少，但转基因株系比野生型的相对更长（图2c和3a）。
图2 野生型烟草和转基因烟草的种子发芽和幼苗生长分析
此外，作者还研究了野生型和转基因株系在不同盐度下干重/鲜重的变化。在正常浇水条件下，野生型和转基因植株的干重/鲜重没有显著差异。然而，当盐浓度达到200mM时，转基因品系的干重/鲜重显著高于野生型品系（图2d和2e）。随后，随着盐浓度升至300mM，转基因和WT株系的重量都显著降低。在正常浇水条件下恢复5天后，EgAP2.25转基因烟草表现出健康的绿叶，而野生型植株枯萎并接近死亡（图3b）。以上结果证明，EgAP2.25的过表达增强了转基因植株的耐盐性。
图3 盐胁迫下EgAP2.25基因表达分析
为进一步评估EgAP2.25的过表达是否可以提高抗氧化酶活性，从而保护转基因烟草株系免受盐胁迫，作者将野生型和EgAP2.25转基因烟草植株置于不同浓度的NaCl进行胁迫处理，发现在0 mM NaCl条件下转基因株系的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）没有差异（图4），但在盐胁迫下，活性显著增加：在100mM NaCl下，SOD活性高于野生型植株（23.08%～34.20%，p<0.05），POD和CAT活性均显著升高（62.29%～64.20%和54.36%～57.10%，p<0.01）；随着NaCl浓度进一步增加到200mM，SOD和POD活性均显著高于野生型植株（40.68%~41.54%，40.31%~42.33%，p<0.01）。
图4 EgAP2.25转基因和WT烟草株系叶片在NaCl胁迫下的抗氧化酶活性
研究还发现，在200 mM NaCl下，转基因株系中MDA的含量为16.953～18.886 µmol·g-1 FW，显著低于野生型（24.673 µmol·g.−1 FWs）（图5a），H2O2含量为4.841～5.101 µmol.g−1 FW，显著低于野生型株系（7.401 µmol·g−1 FW）（图5b），脯氨酸含量与野生型相比显著增加了4~6倍（图5c），可溶性糖含量增加了62.604～64.491%（图5d）。在200和300 mM NaCl浓度下，与野生型植株相比，过表达株系分别显示出更高的叶绿素含量（21.232～21.641%）和（36.584～38.137%）（图5e）和 较低的电解渗漏（13.832～14.503%）和（26.447～27.196%）。
图5转基因和野生型烟草植株在盐胁迫条件下的MDA、H2O2、脯氨酸、可溶性糖、叶绿素含量和相对电导率的变化
然而，在200mM NaCl胁迫下，转基因烟草中的盐度胁迫标记基因都显著过表达，如NtSOD、NtPOD、NtCAT、NtERD10B、NtDREBB、NtERD10C和NtP5CS（图6）。推测EgAP2.25诱导了胁迫相关基因的上调，从而提高了转基因烟草的耐盐性。
图6 盐胁迫下野生型和转基因烟草中的抗氧化酶基因表达。
综上所述，在盐胁迫条件下，过表达EgAP2.25基因提高了转基因烟草中SOD，POD和CAT的活性，增加了脯氨酸、可溶性糖和叶绿素的含量，减少了MDA、H2O2和电解质的积累，诱导了逆境marker基因（NtSOD、NtPOD、NtCAT、NtERD10B、NtDREBB、NtERD10C和NtP5CS）的上调表达，从而增强了转基因株系的耐盐性。相关研究将为油棕耐盐分子辅助育种提供理论依据。
中国热带农业科学院/椰子研究所/热带作物生物育种全国重点实验室周丽霞副研究员为该论文的第一作者；中国热带农业科学院/椰子研究所/热带作物生物育种全国重点实验李睿助理研究员，叶剑秋研究员为该论文的共同通讯作者。该研究得到国家重点研发计划、海南省自然科学基金等项目的资助。
原文链接：https://doi.org/10.3390/ijms25115621
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